免疫沉淀通用实验方案
免疫沉淀（Immunoprecipitation, IP）是一种基于抗原-抗体特异性结合的分子生物学技术，用于从复杂的生物样本中选择性地分离和富集目标蛋白质。这一技术的核心在于利用固相支持物（如磁珠或琼脂糖树脂）上的特异性抗体捕获感兴趣的蛋白质，随后通过洗涤去除非特异性结合的杂质，最终释放纯化的抗原-抗体复合物以供下游分析。
免疫沉淀技术在蛋白质研究中的应用极为广泛，包括但不限于蛋白质-蛋白质相互作用的研究、表位映射、翻译后修饰分析以及基因调控研究。例如，通过免疫沉淀与质谱联用，可以鉴定和表征细胞内的蛋白质复合体和相互作用网络；而染色质免疫沉淀（ChIP）则用于研究蛋白质与DNA之间的相互作用，揭示染色质结构和基因表达调控的动态变化。
此外，免疫沉淀技术还可以与高通量筛选平台整合，系统分析蛋白质相互作用网络，识别新的蛋白质复合体，并揭示细胞过程和疾病背后的信号通路。
本实验方案将针对细胞样本，采用磁珠法介绍免疫沉淀通用实验步骤。
第1阶段 制备裂解物
第一步是在合适的缓冲液中裂解细胞或组织样本，以将蛋白质释放到溶液中。理想的裂解缓冲液将最大限度地减少蛋白质变性，同时从样品中释放足够的蛋白质。
非离子型洗涤剂（如NP-40和Triton X-100）的刺激性小于离子型洗涤剂（如SDS 和脱氧胆酸钠）。其他可能影响免疫沉淀成功的变量包括盐浓度、二价阳离子浓度和pH值。
所需材料
- 合适的裂解缓冲液（例如：N274337）
- 蛋白酶抑制剂混合物（例如：P301903）
- 磷酸酶抑制剂混合物（可选-例如：P666104）
- PBS
实验步骤
1.选择合适的裂解缓冲液。
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整个过程中将样品、缓冲液和设备放在冰上。
2.在缓冲液中添加蛋白酶抑制剂，包括磷酸化蛋白质的磷酸酶抑制剂。
3.分离细胞并将其悬浮在裂解缓冲液中。一般建议1-3×107个细胞添加300 µL裂解缓冲液，3×107个以上细胞添加600 µL缓冲液。如果细胞不能很好地悬浮，可适当增加裂解缓冲液。
4.将细胞与裂解缓冲液在冰上孵育10分钟（不搅拌）。然后将裂解物在冰水中超声处理3次。
注意：该过程可能需要优化。如果细胞仍然聚集在一起，则需使用涡旋进行搅拌。
5.4°C下以8,000 × g的速度离心10分钟，将上清液转移到新管中，并置于冰上。
6.使用Bradford或BCA检测法测定裂解物中的蛋白质浓度。
7.如果不立即使用，请将等分试样快速冷冻在液氮中并储存在-80°C下。
第2阶段 免疫沉淀和清洗
免疫沉淀蛋白质主要有两种方法。第一种方法是将抗体与裂解物混合，然后将 Protein A/G磁珠添加到抗体-裂解物复合物中。这种方法可获得高纯度的蛋白质；然而，抗体也会与目标蛋白质一起洗脱，这有时会给蛋白质印迹检测带来困难。
第二种方法是制备抗体-磁珠复合物，然后将其与裂解物一起孵育以提取目标蛋白质。这种方法的产量比第一种方法要低，但避免了抗体共洗脱的问题。
或者也可以按照以下方案进行IP。如果使用同型对照抗体，您可以采用相同的实验操作，并在分析结果时将其与目标蛋白的IP进行比较。
所需材料
- 裂解物
- 一抗
- 同型对照抗体
- Protein A/G磁珠（例如：P8104、P8103）
- 磁力架
实验步骤
1.将裂解物与抗体在4°C下孵育过夜，轻轻搅拌。
2.将Protein A/G磁珠添加到抗体-裂解物复合物中。一般每1 mL裂解物添加约100 µL磁珠。4°C下轻轻摇动孵育1-4小时。
注意：裂解物和珠子溶液的体积可能需要优化。
3.用PBS缓冲液清洗磁珠三次，以去除未结合的杂质。
3.1将管子放在磁力架上约1分钟；磁珠应被磁铁拉到管子底部。
3.2吸出并丢弃溶液，保留磁珠。
3.3向磁珠中添加约1 mL新鲜裂解缓冲液，并重复上述步骤。
这时，目标蛋白质应该与包被磁珠的抗体特异性结合。
第3阶段 洗脱
洗脱可以在各种缓冲液条件下进行，包括甘氨酸（非变性）、Laemmli（变性）和尿素缓冲液。
在所有这些缓冲液中，含有SDS的Laemmli缓冲液是最严苛的，因为它会连同目标蛋白一起洗脱非共价结合的抗体和抗体片段。相比之下，甘氨酸缓冲液会温和地洗脱蛋白，洗脱的抗体量会减少。
- 甘氨酸缓冲液（非变性）
所需材料
- 0.1-0.2 M 甘氨酸，pH 2.6
- 与磁珠结合的样品
实验步骤
1.将等体积的甘氨酸添加到磁珠中，室温下孵育10分钟，轻轻搅拌。低pH值会将目标蛋白质与抗体磁珠分离。
2.使用磁力架将磁珠与溶液分离。将管子放在磁力架上约1分钟，使磁珠被磁铁拉到管底部。
3.吸出溶液，保留磁珠，然后将该溶液转移到新管中。
提示：（1）有需要的话，可以重复步骤 1-3几次以最大限度地洗脱蛋白质。
（2）可以用裂解缓冲液清洗磁珠以去除甘氨酸，从而使磁珠可以重复使用。
4.加入Tris-HCl中和溶液的pH值。
注意：此时，如果不立即使用，则分装样品，快速冷冻，并储存在-80°C下。
5.使用蛋白质印迹法或其他技术分析IP结果。如果有使用同种型抗体的话，可以将捕获抗体和同型对照抗体所进行的 IP 结果进行比较。
- 变性缓冲液
所需材料
- 变性缓冲液：（例如：0.1 M DTT、1× LDS或任何其他缓冲液）
- 与磁珠结合的样品
- 磁力架或微量离心机
实验步骤
1.将等体积的变性缓冲液加入到珠子中，100°C下孵育5分钟。高温和缓冲液使抗体珠与目标蛋白质分离，同时使蛋白质变性。
2.使用磁力架将磁珠与溶液分离。将管子放在磁力架上约1分钟，使磁珠被磁铁拉到管底部。
3.吸出溶液，保留磁珠，然后将该溶液转移到新管中。
注意：如果不立即使用，则分装样品，快速冷冻，并储存在-80°C下。
4.用Western blot分析IP结果。如果有使用同种型抗体的话，可以将捕获抗体和同型对照抗体所进行的IP结果进行比较。
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