软骨细胞衰老是骨关节炎（OA）的关键驱动因素，线粒体功能障碍和氧化应激可诱导软骨细胞衰老。然而，衰老导致OA进展的具体机制尚不完全清楚。四川大学华西医院黄泽宇和美国希望之城国家癌症中心的郭蔚华团队联合在Advanced Science（IF 14.3）发表题为Dipeptidyl Peptidase 4 (DPP4) Exacerbates Osteoarthritis Progression in an Enzyme-Independent Manner 的文章，研究揭示了DPP4通过非酶依赖途径加重骨关节炎疾病进展的机制，表明DPP4的非酶活性是OA治疗的一个有前景的靶点。
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In vivo
基因信息
DPP4：二肽基肽酶4
病毒产品
AAV2-NC，AAV2-Dpp4-WT，AAV2-Dpp4-MUT
实验动物
10周龄C57BL/6小鼠在DMM两周后注射AAV
18月龄C57BL/6小鼠
注射剂量
10 μL ( 1.0× 1012 vg/mL)
注射方式
关节内注射
AAV2有效感染小鼠软骨细胞
In vitro
病毒产品
Lv-NC，Lv-DPP4-WT，Lv-DPP4-MUT
感染组织
人和小鼠软骨外植体
感染时间
10d
慢病毒有效感染软骨外植体
01 研究结果
1、DPP4过表达激活氧化应激和衰老途径
作者通过分析OA患者以及OA诱导的大鼠和小鼠软骨样本的RNA-seq数据，发现与OA相关的软骨细胞中DPP4的表达升高。为了研究DPP4上调对软骨细胞转录和蛋白质表达的影响，作者在C28/I2软骨细胞中过表达DPP4，并进行了RNA-seq和4D FastDIA定量蛋白质组学分析。RNA-seq分析显示，DPP4上调增加了与氧化应激和细胞衰老相关的基因表达，同时降低了与ECM维持、胶原合成和细胞周期转换相关的基因的表达。在原代小鼠软骨细胞中过表达DPP4，与对照组相比，DPP4过表达细胞衰老加剧。随后，作者使用慢病毒在人和小鼠软骨外植体中过表达DPP4，与对照组相比，DPP4过表达导致软骨基质减少。此外，IF实验表明DPP4过表达上调MMP13，P16INK4A和γH2AX ( DNA损伤标志物)，下调COL2A1。以上结果表明，DPP4过表达可能通过参与氧化应激相关和衰老相关途径来破坏合成代谢和分解代谢之间的平衡。进一步研究发现DPP4以非酶依赖的方式破坏软骨细胞中的线粒体动力学，从而诱导氧化应激和细胞衰老。
图1. DPP4促进软骨细胞氧化应激和衰老
2、软骨细胞中DPP4的过表达加剧了DMM和衰老诱导的OA进展
为研究DPP4在OA小鼠模型中的作用，作者将含有AAV2-NC、AAV2-Dpp4-WT或AAV2-Dpp4-MUT的腺相关病毒注射到小鼠膝关节腔内。通过IF分析检测GFP的表达，证实了AAV2在软骨细胞中的感染。在DMM和衰老诱导的OA小鼠中，与AAV2-NC相比，AAV2-Dpp4-WT和AAV2-Dpp4-MUT组的小鼠OARSI评分更高，Dpp4表达增加。此外，DPP4的上调导致DMM和衰老诱导的小鼠出现更严重的滑膜炎。IHC结果显示，AAV2-Dpp4WT和AAV2-Dpp4-MUT组的小鼠软骨基质成分水平较低，MMP3、CTX-II和衰老相关分子水平升高，并且表现出更多的骨赘形成和软骨下骨硬化。PAM测试发现Dpp4过表达组的小鼠疼痛耐受性较差；步态分析表明Dpp4的上调会导致小鼠运动功能障碍。以上结果表明，DPP4的上调通过非酶依赖机制加剧了DMM诱导和衰老诱导的小鼠OA。
图2. DPP4促进DMM和衰老诱导的小鼠OA进展
3、4,5二咖啡酰奎宁酸可以缓解DMM和衰老诱导的小鼠OA
作者研究发现DPP4以非酶依赖的方式与MYH9结合，通过泛素-蛋白酶体途径阻碍MYH9蛋白的降解，从而上调MYH9蛋白质的表达，导致线粒体功能障碍和细胞衰老。通过筛选发现4,5二咖啡酰奎宁酸可以破坏DPP4和MYH9之间的相互作用，从而促进MYH9的泛素化和降解。接下来作者探究了4,5二咖啡酰奎宁酸是否可以在体内缓解小鼠的OA。在衰老诱导的OA小鼠膝关节内给药AAV2-NC、AAV2-Dpp4-WT或AAV2-Dpp4-MUT。发现与PBS组相比，用4,5二咖啡酰奎宁酸处理的小鼠的OARSI评分较低。IF检测显示，尽管4,5二咖啡酰奎宁酸不能改变DMM手术后软骨细胞中DPP4的上调，但与PBS组相比，它显著降低了MYH9的表达。IF分析显示，与AAV2-NC相比，AAV2-Dpp4-WT和AAV2-Dpp4-MUT仍然上调软骨细胞中Dpp4的表达，但4,5二咖啡酰奎宁酸处理导致这两组软骨细胞中的MYH9没有上调。此外4,5二咖啡酰奎宁酸有效地改善了OA小鼠的疼痛耐受性和运动功能。以上结果支持4,5-diCQA有效缓解DMM和衰老诱导的小鼠OA的进展。
图3. 4,5二咖啡酰奎宁酸可以缓解DMM和衰老诱导的小鼠OA
02小结
本研究发现软骨细胞中DPP4的过表达加重DMM诱导和衰老诱导的小鼠OA，DPP4抑制MYH9的泛素化和降解，而不依赖于其酶活性，导致线粒体功能障碍和细胞衰老。此外，利用4,5二咖啡酰奎宁酸降低MYH9水平可以缓解DMM和衰老诱导的小鼠OA症状，以上表明DPP4的非酶活性是OA治疗的一个有前景的靶点。